Double cut의 경우 서로 다른 제한효소로 자른 경우가 아니고 같은 제한효소로 자른 경우 ligation 시에
거꾸로 들어가는 경우가 있다. 물론 이때 서로 다른 제한효소라도 compatible end를 가져서는 안된다.
이때 protein이 정상적으로 만들어지지 않는다. promoter는 한쪽으로만 작용하고 거꾸로 들어간 경우 완전히 다른 유전자가 되기 때문이다. 한 유전자의 반대 방향으로 삽입된 경우 거의 대부분 stop codon이 많이 나온다.
물론 세가지 reading frame 모두.
거꾸로 들어갔는지는 일단 제한 효소로 잘라보면 알 수 있다. 만약 반대방향으로 삽입되었다면, vector와 insert, 모두에 있는 제한효소site로 자르면 반대로 들어간 것은 서로 다른 패턴으로 나온다.
또한 PCR로도 검색 가능하다. 한 primer는 벡터에, 다른 primer는 insert에 붙는 것을 사용하면 가능하다.그리고, 이론적으로 생각하면 한 방향으로 들어갈 확률 50%이지만 실제로는 보통 한쪽으로만 들어간다.
