리보핵산(RNA) 간섭 기술은 세포 내에 존재하는 리보핵산(RNA)의 제어를 통해 명령체계를 바꾸어 질병을 치료하는 바이오테크 기술로서 일반적으로 RNAI(I는 Interference)라고 칭한다. 이는 제약분야의 IT라고 불린다.
RNA내에 있는 한 정보체계가 정상궤도에서 벗어나 이상질환을 유발하는 단백질을 생산하도록 지시할 경우 이를 인위적으로 간섭하여 질병발생을 억제하도록 하는 것이 RNAI의 원리이다.
[2] 예측과 전망
이제까지는 개발단계에 있었기 때문에 지난해 시장규모는 제로상태였지만 오는 2010년에 는 17억 달러에 이를 것으로 업계 전문가들을 예측한다.
현재 C형 간염과 루게릭 병 등 일부 병의 경우 치료기술이 거의 막바지 단계에 와 있으며 올해 안으로 결과가 나올 것으로 예상된다. 다른 유전공학적 치료법과는 달리 RNAI 기술은 객관적 검증이 이뤄졌으며 머지 않은 장래에 보편적인 기술로 자리잡게 될 전망이다.
이 기술을 응용하면 당뇨병이나 각종 암들도 정복될 수 있을 것으로 전문가들은 내다보고 있다.
[3] 구체적인 원리와 내용 (한겨레 신문 무단 복제및 전재 금지 요망)
생명체의 세포는 현미경 슬라이드 위에서나 확인할 수 있다. 1조배를 확대해도 수mm를 벗어나지 않을 정도로 미세한 세포 안에서는 무수한 생화학적 반응이 일어난다. 이 세포 속에는 수천개의 유전자로 구성된 DNA가 있다. DNA가 생화학적 작용을 하는 데는 RNA가 필수적이다. DNA 이중나선은 단일 가닥으로 풀리면서 RNA로 전사된 뒤 내포된 정보를 단백질의 형태로 바꾸게 된다. 만일 유전자들이 모두 RNA로 발현되면 생명체가 혼돈에 빠진다. 인간이라면 암이나 질병에 걸리는 것이다.
유전자는 특정 단백질 생산을 최종 목표로 삼는다. 유전인자들이 RNA 정보를 마음대로 퍼뜨려 생명력을 발휘하려고 몸부림치는 이유가 여기에 있다. 만일 모든 유전자가 단백질로 발현되면 생명체가 암 덩어리로 바뀔 수 있다. 마치 바이러스가 유전 정보를 퍼뜨리면 세포의 단백질 생산 공장이 바이러스의 단백질을 만들어내는 것처럼 되는 것이다. 단백질을 만드는 데 필요한 유전자가 발현되지 못하도록 해야만 생명이 유지되는 셈이다.
모든 유전자가 멋대로 단백질이 되는 것은 ‘마이크로 RNA’에 달려 있다. 인간은 200여종의 마이크로 RNA를 가지고 있다. 이들은 유전자의 발현을 조절해 세포가 적절한 시기에 조직과 기관으로 분화하도록 한다. 바로 적대적인 유전자로부터 세포를 보호하고 성장과 발생 과정에서 정상적인 유전자 활동을 돕는 ‘RNA 간섭(interference)’(RNAi)이 이뤄지는 것이다. 놀라운 것은 인위적으로 RNAi를 유도하면 질병을 예방하거나 치료할 수도 있다는 사실이다.
그토록 신비한 생명체의 메커니즘이 차츰 밝혀지고 있다. RNAi가 작용하는 과정은 이렇다. 세포 내에서 이중 가닥 RNA가 특정 효소와 마주치면 화학반응을 일으키면서 22개의 핵산으로 이뤄진 RNA 단편을 분해한다. RNAi를 이용한 유전자 억제 기술은 바이러스 감염이나 특정 유전·단백질 질환 등의 치료법으로 주목받고 있다. 지금까지 소아마비, C형 간염 바이러스, HIV 등의 바이러스가 인체에서 증식하지 못하는 데 일부 성공했다. 하버드대 연구팀은 간염의 진행을 늦췄다는 실험 결과를 발표하기도 했다.
이런 환상적인 유전자 억제 기술을 인체에 적용하기까지는 적지 않은 시간이 지나야 한다. RNA 단편을 인위적으로 체내에 주입하는 방법을 개발하는 게 만만치 않기 때문이다. RNA 단편은 기존의 약물보다 성분이 커서 경구용으로 복용하면 소화관에 흡수되지 않고 파괴될 가능성이 크다. 현재 관심을 모으는 방법은 유전자 치료에 이용하는 변형 아데노 바이러스에 RNA 단편을 넣어 체내에 전달하는 것이다. 유전자 검사가 예방의학을 한 단계 끌어올린다면, RNA 간섭은 치료의학에 획기적 전기를 마련할 것이다.
[4] 연구 과정 및 발견 개요
http://mouse.snu.ac.kr/research/RNAi.htm 사진 참조(FG 1~5)
가>RNAi 방법의 작용 원리
RNAi는 (Fig 1.)에서와 같이 특정 유전자의 dsRNA를 미세주입 또는 transfection으로 세포 내에 주입하면 그 유전자의 mRNA만를 특이적으로 분해하게 되는 방법이다, 이 방법은 최근까지 C. elegans에서 유전자의 기능을 연구하는데 많이 이용되었으나, 포유동물인 생쥐의 초기배아에서도 RNAi방법이 수정체에 dsRNA의 미세주입을 통해서 적용될 수 있음을 보여주는 결과(Wianny et al., Cell 2:70, 2000)가 발표되었다.
현재 RNAi의 메커니즘은 명확하게는 밝혀져 있지 않았고, RNAi는 세포의 RNA virus에 대한 방어 기작으로 존재한다는 가설이 현재 제시되고 있다.
나>RNAi 작용 메커니즘 모델
세포내에 dsRNA가 들어오게 되면 dicer라는 enzyme이 dsRNA를 인지하여 dsRNA를 21-23 bp 정도의 크기로 자르고, 잘려진 21-23 bp의 dsRNA를 RNA induced gene sciencing complex (RISC)가 인지하고, binding하여 상보적인 sequence의 mRNA에 가서 붙어서 그 mRNA의 분해를 유도한다는 모델
*밑에 nature reference 주소에 가시면 더 자세한 설명과 함께 동영상을 보실 수 있습니다.
다>RNAi 방법을 초기배아에 적용한 경우
특정 유전자의 dsRNA를 in vitro에서 합성해서 미세 주입으로 초기배아에 넣어주거나, 유전자의 dsRNA를 만들 수 있는 vector를 넣어주어 특정 유전자의 발현을 특이적으로 억제할 수 있다. 미세 주입 후에 많은 발생과 세포 분열에 관련된 특정유전자의 기능을 다양한 실험 방법을 사용해서 분석할 수 있다. RNAi 방법을 초기배아에 적용한 경우를 보면 생쥐의 초기 배아에서 RNAi 방법이 사용되어 특정유전자의 발현을 특이적으로 억제할 수 있음을 (Fig 2. Wianny et al., Cell 2:70, 2000)를 보면은 MmGFP 형질전환 생쥐에서 MmGFP가 제대로 발현이 됨을 (Fig 2a-c.)에서 알 수 있고, MmGFP dsRNA를 생쥐의 초기배아 수정체에 미세주입 했을 때, MmGFP의 발현을 억제함을 (Fig 2d-f.)에서 나타내고 있다. 난모세포에서 제 2 감수분열을 유지하는데 관여하는 c-mos 유전자의 dsRNA를 미세주입 했을 때는 MmGFP의 발현에 영향을 미치지 못한다(Fig 2g-i.). 이를 통해서 특정 유전자의 dsRNA가 특이적으로 작용해서 발현을 억제할 수 있음을 알 수 있다
RNAi 방법이 초기배아의 수정체에 존재하고 초기발생에 중요하게 관여하는 모계영향유전자의 mRNA의 발현에도 영향을 줄 수 있는데, (Fig 3. Wianny et al., Cell 2:70, 2000)에서 보면은 초기배아 수정체에 MmGFP mRNA를 미세주입하여 3.5 일 배양하면 (Fig 3a.)와 같이 상실배에서 MmGFP 발현을 관찰할 수 있다. (Fig 3b.)는 MmGFP mRNA와 세포부착에 관여하는 E-cadherin dsRNA를 같이 미세주입한 것으로 MmGFP의 발현에는 변화가 없는 것을 알 수 있다. (Fig 3c.)는 MmGFP mRNA와 MmGFP dsRNA를 같이 주입하면 특이적으로 MmGFP의 발현이 억제되었음을 통해서, RNAi 방법을 이용하면 유전자 제거생쥐에서 불가능한 초기배아의 세포기질에 존재하는 모계영향유전자의 mRNA도 영향을 미침을 알 수 있다
라>RNAi 방법을 통한 Nek2 유전자 발현억제 연구
Nek2는 centrosome separation과 maturation등에 관여한다고 알려진 centrosome protein이다. 본 실험실에서는 생쥐의 초기배아에서 RNAi 방법을 이용해서 Nek2가 초기 생쥐의 발생에 미치는 영향을 조사하였다. Nek2를 초기배아의 세포분열에서 위치를 살펴보면 (Fig 4.)에서와 같이 세포분열 전반적으로 centrosome에 위치하고 pro, metaphase에는 chromosome에 위치하며, telophase에는 midbody에 위치하고 있다. 이와 같은 Nek2의 다양한 subcellular localization을 통해서 Nek2가 mitosis과정에서 다양한 기능을 가진 regulator라는 가능성을 보여주고 있다. RNAi를 통해 Nek2의 발현을 억제했을 때 나타나는 phenotype을 (Fig 5.)에서 보면 배아의 발생에 영향을 주지 않는 dsRNA GFP는 hatching이 일어나는 발생까지 정상적으로 발생하는 것을 관찰할 수 있고, dsRNA E-cadherin은 knockout phenotype과 비슷하게 compact morula까지는 정상적으로 발생하지만 다음 단계에서 cavitation이 제대로 일어나지 못하거나 일어나더라도 비정상적으로 일어남을 볼 수 있다. dsRNA Nek2를 microinjection하여 Nek2의 발현을 억제하면 그림에서와 같이 전반적으로 비정상적인 발생을 관찰할 수 있다. Nek2가 억제되었을 때 나타나는 phenotype과 대표적 mitotic regulator로 알려진 inner centromere protein, Aurora 그리고 survivin등의 유전자를 억제했을 때 나타나는 phenotype을 비교하여 Nek2의 역할을 연구하고 있다.
[5]김지혜, 노미진, 고현명 연구 결과 논문 레포트 中 일부 발췌
RNAi - A Powerful Reverse Genetic Tool 2004. 4. 1. 목 김지혜, 노미진, 고현명
Introduction
그동안 RNA는 DNA에 담겨있는 유전정보를 단백질로 변환시키는 과정에서 단순히 전달자의 역할만 하는 조연으로 인식되었으나, 다양한 형태로 존재가 알려지고 있는 small RNA가 유전자의 발현조절 과정에 다양한 형태로 관여하여 세포의 기능을 총괄 조정하는 지휘자로 밝혀지면서 RNA연구에 가속도가 붙었다.
Terminology
1) miRNA
ss(single-strand)RNA 분자로서, 진핵생물의 유전자 발현을 제어하는 새로운 조절물질.
2) siRNA
ds(double-strand)RNA가 dicer에 의해 절단되어 생성되는 21~25nt(nucleotide)크기의 작은 RNA 조각으로 상보적인 서열을 갖는 mRNA에 특이적으로 결합하여 단백질 발현 억제
3) RNAi
특정 gene의 dsRNA를 미세주입 또는 transfection으로 cell내에 주입하면 그 유전자의 mRNA만을 특이적으로 분해하게 되는 방법.
* reverse : 어떤 기능을 하는 protein이 발견된 경우, 그것이 어떤 유전자로부터 나온 것인지를 cental dogma의 역방향
(protein->mRNA->DNA)으로 찾아내는 방법.
Reference
www.bric.postech.ac.kr
www.ambion.com
www.ncbi.nlm.nih.gov
www.vectorcorea.com
www.sciencedirect.com
http://www.nature.com/focus/rnai/animations/animation/animation.htm
