GenBank에서 찾은 p53의 DNA sequence
1 gtctagagcc accgtccagg gagcaggtag ctgctgggct ccggggacac tttgcgttcg
61 ggctgggagc gtgctttcca cgacggtgac acgcttccct ggattggcag ccagactgcc
121 ttccgggtca ctgccatgga ggagccgcag tcagatccta gcgtcgagcc ccctctgagt
181 caggaaacat tttcagacct atggaaacta cttcctgaaa acaacgttct gtcccccttg
241 ccgtcccaag caatggatga tttgatgctg tccccggacg atattgaaca atggttcact
301 gaagacccag gtccagatga agctcccaga atgccagagg ctgctccccc cgtggcccct
361 gcaccagcag ctcctacacc ggcggcccct gcaccagccc cctcctggcc cctgtcatct
421 tctgtccctt cccagaaaac ctaccagggc agctacggtt tccgtctggg cttcttgcat
481 tctgggacag ccaagtctgt gacttgcacg tactcccctg ccctcaacaa gatgttttgc
541 caactggcca agacctgccc tgtgcagctg tgggttgatt ccacaccccc gcccggcacc
601 cgcgtccgcg ccatggccat ctacaagcag tcacagcaca tgacggaggt tgtgaggcgc
661 tgcccccacc atgagcgctg ctcagatagc gatggtctgg cccctcctca gcatcttatc
721 cgagtggaag gaaatttgcg tgtggagtat ttggatgaca gaaacacttt tcgacatagt
781 gtggtggtgc cctatgagcc gcctgaggtt ggctctgact gtaccaccat ccactacaac
841 tacatgtgta acagttcctg catgggcggc atgaaccgga ggcccatcct caccatcatc
901 acactggaag actccagtgg taatctactg ggacggaaca gctttgaggt gcgtgtttgt
961 gcctgtcctg ggagagaccg gcgcacagag gaagagaatc tccgcaagaa aggggagcct
1021 caccacgagc tgcccccagg gagcactaag cgagcactgc ccaacaacac cagctcctct
1081 ccccagccaa agaagaaacc actggatgga gaatatttca cccttcagat ccgtgggcgt
1141 gagcgcttcg agatgttccg agagctgaat gaggccttgg aactcaagga tgcccaggct
1201 gggaaggagc caggggggag cagggctcac tccagccacc tgaagtccaa aaagggtcag
1261 tctacctccc gccataaaaa actcatgttc aagacagaag ggcctgactc agactga
여기에서 우리가 실험에서 증폭할 부위는 녹색과 청색으로 표시한 부위이며, 그 중 증폭에 사용할 primer 부위가 녹색이라 할 때, 왜 이렇게 정했는지, 실험의 목적에 따라서 어떻게 디자인하는 지에 대한 설명.
1) 관심있는 부분이 포함되어야 한다
만약에 필요한 부분이 ORF라고 해 봅시다. 대개 단백질의 expression을 위해서는 ORF 전체가 필요하게 됩니다. 이 경우 관심있는 부분은 ATG initiation codon으로부터 TGA termination codon이 됩니다. 따라서 primer는 두 codon을 포함하든지 아니면 그보다 바깥 쪽에서 선정되어야 합니다. PCR에서 증폭되는 부분은 두 primer를 포함한 가운데 부분이기 때문입니다.
여기에서는 우리가 찾을 돌연변위 부위가 잘 발생한다고 알려진 부분을 고려해서 위와 같이 중간 쯤에서 primer를 선정한 것입니다.
2) 증폭하려는 부위의 크기를 고려해야 한다
RT-PCR에서는 위에서 말한 것처럼 단백질의 expression을 위해서 ORF 전체가 필요한 경우도 있지만, 대개는 어떤 mRNA가 존재하는지의 조사를 위해서 하는 경우가 많습니다. 이렇게 존재 유무를 검사하는 경우는 필요없이 길게 PCR 할 필요가 없겠지요. ORF 전체가 목표인 경우는 크기가 그냥 정해지지만 ORF의 일부만 detection 할 경우라면 대개 200 - 400 bp 정도를 PCR하는 것이 좋습니다. 가장 안정적으로 PCR이 되는 크기입니다.
위 염기서열에서 디자인한 primer를 쓰면 233 bp의 DNA가 증폭될 것입니다.
3) GC content와 primer length
관심있는 부위와 길이가 결정되었다면 염기서열을 살펴가면서 primer를 선정해봅니다. 그런데 이때 중요한 것은 G와 C의 비율, 그리고 primer의 길이입니다.
위에서도 설명했지만 염기간의 결합은 G와 C는 세군데에서 수소결합이 일어나고, A와 T는 두군데에서 결합이 일어납니다. 그러니까 primer의 길이가 길수록, 같은 길이라면 GC가 많을수록 primer와 template 사이에 형성되는 수소결합의 수가 많아집니다. 따라서 template를 denature 시킨 후에 온도를 낮추어 annealing이 되는 온도 시점은 수소결합의 수가 많을수록 높아지게 됩니다. 즉 온도를 적게 내려도 수소결합이 많으면 annealing이 되는 것이지요.
그러므로 primer의 선정시에 두 primer 사이에서 GC content와 length는 일치시키는 것이 좋겠습니다. 두 primer의 annealing temperature가 다르면 반응에 지장을 줄 수 있습니다.
물론 아무리 일치시키려고 해도 안되는 경우도 있지만 그런 경우를 제외하면 선정할 부분을 앞 뒤로 움직여가면서 GC content가 50% 내외, primer length가 20개 정도인 부분을 고르는 것이 좋습니다. 저는 대개 20mer(길이가 20 base라는 말입니다)의 primer에 GC가 9개-11개 정도인 것을 찾습니다.
이런 것을 이해하려면 Tm 값이라는 것을 알아야하는데, 더 자세한 것은 관련 서적을 참고해보시기 바랍니다. 여하튼 두 primer의 Tm 값을 일치시키는 것이 중요하다는 것을 말씀드립니다.
4) 이상한 염기서열은 피하라
기껏 위 원칙에 따라 선정하고보니 primer가 GGGGCCCCGGTTTTAATTAA라고 해 봅시다. 원칙에는 맞지만 도대체 반응이 되겠습니까? 눈으로 살펴서라도 너무 이상한 염기서열은 피해야 합니다.
눈으로 확인하기는 어렵지만, primer 내부에서 annealing이 일어날 수 있는 염기서열도 피해야 합니다. 예를 들어 GGCAATT......AATTGCC라는 primer는 primer끼리 붙을 수도 있고 primer 내부에서 hairpin처럼 annealing 될 수도 있습니다. 이런 것 때문에 primer를 선정해 주는 프로그램도 나와 있습니다. 가능하다면 프로그램을 써서 디자인한 것을 검토해보는 것도 좋겠습니다. 하지만 프로그램으로 디자인하는 것도 위와 같은 원칙에 의한 것임을 명심하고 이런 내용을 알아야 한다는 것을 강조하고 싶습니다.
5) 합성될 때의 사정을 고려하라
이것도 조금 어려운 내용이지만, primer에 포함되지는 않았어도 증폭되는 부위에 너무 GC content가 높다거나 다른 secondary structure를 형성할 수 있는 부위가 있으면 잘 안될 것입니다. 특히 primer의 바로 downstream에 GGGGCCCCGGGCC... 와 같은 부위가 있지 않도록 디자인해야 합니다.
합성될 때를 가정해서 검토를 할 것이 또한가지 있습니다. 원칙에 따라 잘 디자인해놓은 primer의 염기서열이 재수없게 이 유전자에 또 한 부분 있다고 해 봅시다. 합성이 잘 되지 않겠지요.
수고스럽지만, 선정된 primer와 유사한 염기서열이 다른 부분에 존재하는지 유사성 검색을 해 볼 필요가 있습니다. 이것은 눈으로는 하기 힘들고 DNAstar나 VectorNTI 등을 이용해야 합니다.
이 유전자 말고 다른 유전자에 비슷한 부분이 있으면? 이런 의문이 들 수도 있습니다. 사실 이런 것도 반응에 영향을 줄 수 있지만, 이 경우는 정말 재수없게 선정한 두 primer가 모두 쌍으로 비슷하지만 않으면 반응에 지대한 영향을 주지는 않을 것입니다. 하지만, 이런 마지막 고려 사항이 종종 장애가 됩니다.
Primer의 주문
721 cgagtggaag gaaatttgcg tgtggagtat ttggatgaca gaaacacttt tcgacatagt
781 gtggtggtgc cctatgagcc gcctgaggtt ggctctgact gtaccaccat ccactacaac
841 tacatgtgta acagttcctg catgggcggc atgaaccgga ggcccatcct caccatcatc
901 acactggaag actccagtgg taatctactg ggacggaaca gctttgaggt gcgtgtttgt
961 gcctgtcctg ggagagaccg gcgcacagag gaagagaatc tccgcaagaa aggggagcct
위와 같은 primer 부위를 선정하여 합성할 준비가 되었으면 올바른 염기서열을 적어서 합성해주는 회사에 보내면 됩니다. 해외로 주문할 수도 있고 국내에 주문할 수도 있습니다.
아래와 같은 양식(꼭 이런 양식을 쓸 필요는 없읍니다)에 primer 염기서열을 적어서 팩스로 보내면 됩니다. 항상 5' 에서 3' 방향으로 쓰게 되어 있으므로 upstream 과 downstream primer 의 방향을 잘 확인하고 씁니다. 그리고 염기 중 G는 알아보기 쉽도록 소문자 g로 쓰도록 되어 있습니다. 팩스로 받으면 G와 C가 헷갈리거든요. Service type이나 oligonucleotide amount는 원하는대로 쓰고 purification type은 대부분 PAGE 까지는 필요없고 SEP-PAK 등 기본 정제면 충분합니다.
