BioloGical BloG

1. pGEX vector & The host

1) pGEX vector GST-recombinant protein의 제작에 있어서 쓰이는 vector는 pGEX vector입니다. 이 벡터의 앞부분에는 GST을 coding하고 있는 sequence가 있습니다. 기본적으로 모든 pGEX vectors는 발현 조절 promoter로서 tau promoter가 있으며, 이 promoter는 Isopropyl β-D thiogalactoside (IPTG)에 의해 발현 유도가 됩니다. 게다가 모든 pGEX vector에는 tau promoter말고 내부의 lacIq gene에 의해서도 조절이 되는데, 이 lacIq gene의 산물은 tau promoter의 operator부분에 붙어 repressor의 역할을 하고, IPTG에 의해 유도 될 때까지 insert된 유전자의 발현을 막고 있어, 결과론 적으로 insert의 over-expression의 밀접하게 조절하는 격이 됩니다.

pGEX vector는 총 10개의 종류가 있으며, 크게 분류하자면 4가지의 vectors (pGEX-P, pGEX-T, pGEX-X, pGEX-2TK)가 있습니다. pGEX vectors의 기본적인 특징은 위에서 언급한것과 같지만, 나중에 GST을 제거하여 insert protein만 얻을 때 필요한, cleavage site의 종류가 다릅니다. (그림 참조)

2) The Host 비록 pGEX vector을 가지고 cloning과 expression에 사용할 수 있는 E.coli host strains을 다양하지만, full-length fusion proteins의 발현을 최대화 할 수 있고 더 안정된 특별히 제작된 stains이 있습니다. 특히 cytoplasmic protease gene products로 알려진 Lon, OmpT, DegP or HtpR들이 없는 균주들은 그 균주로 부터 proteolytic degradation의 영향들을 최소화 함에 따라 그 fusion proteins의 발현에 도움을 줄 수 있습니다. ※ Not protease-deficient을 가진 E.coli 균주를 사용할 경우 fusion protein의 proteolysis의 결과를 줄 수 있습니다. Omp 와 Lon protease production이 결핍되어 있는 균주인 E.coli BL21은 GST fusion protein의 High level expression을 나타내는 균주로 특히 현재까지 선택 되어지고 있습니다. ※ BL21은 Transform이 잘 않되게 때문에 다른 균주(cloning and maintenance of vector에 많이 쓰이는 균주 e.g. JM105)을 사용할 수 도 있다. 하지만, gene의 발현에 있어서의 연구는 BL21 균주가 선택적으로 쓰이고 있습니다. 그리고, pGEX plasmid의 증폭에 있어서 recA1 allele을 가지고 있는 E.coli strain은 사용하지 말아야 합니다. 그들은 plasmid DNA안에 rearrangements or deletions을 야기 할 수 있다고 보고되고 있기 때문입니다.

2. Overview; GST-Recombinant Protein Purification

전체적으로 간략하게 보면, 일단 insert DNA가 들어가있는 pGEX vector을 먼저 sequencing analysis을 거쳐 정확하게 sequence flame이 맞는지 확인 합니다. 확인된 그 plasmid를 BL21에 transformation합니다. 그 transformed BL21을 적당히 키운 상태에서 IPTG을 넣어서 GST-fusion (GST-recombinant) proteins을 발현 시켜줍니다. 발현 후에 그 cell을 sonication시켜서 cell 내용물들이 buffer안으로 녹아 나오게 하고, pellet은 제거합니다. 그리고 그 상층액만을 모와서 glutathione-sepharose beads을 넣어주어서 GST-fusion proteins을 붙게 한 후, 침전시켜서 그 침전 된 것을 모아서 elution하여 GST-fusion proteins만을 모으면 됩니다. 더 나아가 cleavage단계를 거치면 원하는 recombinant proteins만을 얻을 수 있습니다. (아래 그림 참조)

3. Control points

자. 이제부터 실험하는 사람이 어떠한 전략을 짜느냐가 중요합니다. Recombinant Proteins purification은 실험과정, 실험환경 그리고 실험원의 차이에 따라서도 결과가 다르게 나올 수 가 있기 때문입니다. 한번에 성공하기 보다 실험을 하면서 자신 스스로 set-up을 하나씩 해나가면서 실험을 해야 합니다. Fusion-protein purification의 최대의 적은 inclusion bodies입니다. 하지만, inclusion bodies을 적을 로만 생각할 것이 아니라, 적을 알면 내가 이기듯 inclusion이 생기는 원인을 자세하게 분석하면서 실험 조건을 변화시켜 최종적으로 Optimizing for soluble expression을 정하는 것입니다. 일반적으로 High-level expression of foreign fusion proteins in E.coli은 종종 inclusion bodies을 형성 할 수 있습니다. Inclusion bodies는 folding intermediates에 실패되어 불용성으로 뭉치고 뭉친 것들입니다. Inclusion bodies가 생기면 거부보단 그 결과를 받아드리되, 그 proteins을 solubilize와 refold 되도록 전략을 발전시켜야 됩니다. 다양한 배양의 parameters을 한가지 또는 여러 가지를 바꿔가면서 실험에 투자하면 soluble fraction에서 non-degraded fusion protein의 좋은 효율을 제공할 수도 있습니다. 간단하게 그 투자할 단계는: * 배양 온도를 20℃와 30℃사이로 낮춰보는 것입니다. * rpm을 높여 aeration을 증가시킵니다. * Induction 조건을 바꿉니다. 일반적으로, 낮은 세포들의 농도(A600=0.5)에서 Induction은 보통 soluble form과 함께 fusion protein의 좋은 수율을 가져옵니다. 하지만 특별한 경우는 세포를 높은 세포 농도로(>1A600 unit) 키우는 것이 이득이 될 수 도 있습니다. 세포를 높은 농도로 키워가고 동시에 IPTG가 넣지 않던가 IPTG의 농도를 0.1mM까지 낮춰가면서 실험을 해봅니다. 물론 수율은 작아지겠지만, fusion protein을 좀더 intact form으로 proteins을 얻을 수 있게 됩니다. ※ 만약 the plasmid를 E.coli strain BL21가 아닌 다른 host에서 증식을 했다면, fusion protein의 발현을 위해서는 BL21으로 이동시켜 줍니다. ※ 각 중요한 단계들에 소량의 sample의 남겨둡니다. Induction 전도 포함하고, Induction 후에 다양한 시간대 별로 그리고 purification 단계들 동안에도 남겨두어서 growth 와 purification methods을 분석하시면 됩니다. 일단 분석이 완료되면, 그 positive clones의 glycerol stocks을 준비하고 -80℃에 저장합니다. Fusion proteins purification 시 생각해 볼 control points이 있습니다. 아래 그림을 참조하면서 보시면, IPTG의 양, 발현시 배양 온도, fusion protein의 성질, induction 시간, 얼만큼 배양시킬 것과 Handling을 생각할 수 있습니다. 그리고 그러한 단계들을 거치면 또 다시 주의와 결정해야 될 것이, sonication의 시간, lysis시킬 volume, 적당한 lysis buffer의 선택과 그리고 4℃로 유지하여 protease로부터 proteins이 분해되는 것을 막는 것 등 입니다.

4. Important points

Controls points를 지나서 다음으로 중요하게 생각할 점들이 있습니다. 아래의 그림을 참조하시면 됩니다. 일반적으로 glycerol stock clone이나 agar medium에 있는 clone들을 이용하여 expression of fusion protein을 할 때, colony을 바로 접종하여 원하는 농도에서 IPTG을 넣는 것 보다는 seed culture을 한번 해주는 것이 일반적 입니다. 이렇게 하면 장점은 같은 colony로부터 여러 조건들을 변화시킬 수 있는 실험을 할 수 있다는 것과, 한번 seed을 해주고 본 접종에 들어가면 그만큼 균들의 상태가 좋아 진다는 것이 됩니다. 그리고 IPTG의 농도입니다. 여러 참고문헌 에서는 IPTG의 농도를 결정시에 0.1mM~1.0mM까지 넣어준다고 합니다. 하지만 실험에 사용할 때는, 앞서 설명한 봐와 같이 IPTG농도를 적은 상태에서 발현이 잘 되도록 조건 잡는 것이 유리합니다. 마지막으로 중요한 점은, 배양 온도 입니다. 실질적으로 배양을 어떻게 시키느냐에 따라 Inclusion body의 유무와 양이 결정된다는 것을 가장 기본적으로 염두 해 두어야 할 사실 입니다. 가장 좋은 조건은 37℃가 되겠지만, inclusion body가 생기면은 일단 온도를 낮춰가면서 조건을 잡아가시면 됩니다. 일반적으로 fusion protein의 크기가 크면 클수록 낮은 온도에서 배양을 한다고 합니다.

5. Determine points -Quality of Proteins

우리가 분리하고 하는 단백질의 성질을 분석하는 것도 매우 중요합니다. 일반적으로 GST는 26kDa입니다. 예를 들어, GST을 tagging하고 있는 fusion proteins 자체가 14~15kDa이라합시다. 일반적으로 이런 크기의 proteins은 purification하는데 보통 손쉽게 할 수 있습니다. 하지만, 그렇지 않는 경우가 있습니다. 그것이 바로 nuclear proteins입니다. 이 proteins들은 DNA에 붙는 단백질이라는 사실을 잊고서 purification하면은 inclusion body에 좋은 효율을 못 얻을 것입니다. Sonication시에는 세포 안의 chromosome들이 짧은 단편으로 조각이 나게 됩니다. 일반적으로 DNA는 pellet으로 가게 됩니다. 그럴 경우 nuclear proteins에도 그런 DNA조각들이 붙게 되어 pellet으로 가게 됩니다. 그리고 크기가 큰 proteins일수록 발현을 시키는데 어렵습니다. 그리고 발현이 되었더라도 큰 단백질이라 박테리아 세포 안에서는 그것을 불용성으로 되게 만들어 버립니다. 또한 단백질의 기본을 이루고 있는 amino acid sequences을 바탕으로 2차 구조는 그것의 solublity에 영향을 줄 수 있습니다.

6. Determine points -Maintenance of Proteins

Cell sonication후에는 우리가 원하는 단백질을 포함 여러 단백질도 나오게 되고 그중에는 protease도 나오게 됩니다. 이런 상황에 있어서 그런 protease의 action을 저해 시키기는 것은 가장 기본적으로 실험할 때 지켜야 할 상황입니다. Protease의 활성을 저해 시키기 위해 모든 과정을 ice 위에서 하는 것도 그 이유이며, 적당한 protease inhibitor을 첨가 해줍니다. 그리고 Sonication 과정에서도 잘못된 sonication은 단백질을 denature시키기 되며 결과론 적으로 insoluble화 됩니다. 그리고 lysis buffer 조성에 DTT가 들어 가게 됩니다. DTT는 항상 모든 단계에서 1mM로 유지시켜주어서 Protein-Protein aggregation을 막아서 inclusion body을 형성을 억제해 줍니다. 그리고 inclusion body는 제대로 folding이 되지 않은 것들이 포함되어 있어서 배지에 2% ethanol을 첨가해주면 세포내의 chaperons이 증가하게 되어 proteins의 folding이 증가됩니다. 물론 에탄올로 인해 배양 속도는 저하됩니다.

7. Buffers and stock solutions

8. GST & GST-H2AX Protein purification procedure

1). insert와 pGEX vector의 flame이 맞은 positive clone을 BL21 E.coli에 transformation합니다. 그리고 그 균주를 적당량 배양하여 -80C에 보관합니다. 보관중엔 Stock 균주를 꺼내어 Agar medium에 streaking하여 하루 배양합니다.

2). 배양시킨 agar 배지로부터 한 개의 colony을 골라 3ml medium + Amp에 접종합니다. 이단계가 seed culture입니다. 그것을 shaking incubator에서 37℃로 하루 배양합니다. 그리고 본 접종에 필요한 배지의 양을 정한 후, 삼각플라스크에 그 배지를 제조 후, Autoclave살균 시킵니다.

3). 살균된 medium에 Ampicillin을 넣은 후, 1:1000 or 1:500 or 1:100으로 접종합니다. ※ 여기서 pGEX만 들어간 BL21도 동시에 키워야 합니다. GST의 발현과 비교하기 위해 서입니다. 즉 GST alone과 GST-fusion proteins을 동시에 purification합니다. 처음 하시는 분은 일단 GST purification에 먼저 set-up을 한 후, GST-fusion protein purification을 들어갑니다. 4). 그 cells을 OD(A600=0.4, 0.6, 0.8)등으로 키웁니다. * 즉 IPTG을 넣기 전의 cells의 최적 밀도를 정합니다. 표준은 0.4값에서 IPTG을 넣어서 induction하지만, 여러 OD값에서 접종을 하여서 자신의 실험에 맞은 최적 조건을 잡아 가야 합니다. 5). IPTG을 0.1mM~1mM로 넣고, 배양(즉, Induction)을 시킵니다. * IPTG의 농도도 gene expression에 영향을 줍니다. IPTG는 reversible하기 때문에 저 농도에서도 충분히 발현된다는 것을 알고, 일반적으로 0.5mM이하로 induction 조건을 잡습니다. 그리고 배양온도도 중요합니다. 일단 먼저 37℃로 배양을 시킵니다. 후에 실험한 결과 inclusion body로 간다면 온도를 일단 25℃로 낮춰서 배양합니다. 어느 실험이건 먼저 37℃을 기준으로 실험을 해야 합니다. 37℃로 induction시키면 그만큼 배양시간이 1~2시간 정도로 짧게 되지만, 25℃이하는 일반적으로 overnight induction을 하기 때문에 시간상으로 1day을 절약할 수 있기 때문입니다. 그리고 배양 시간도 영향을 줍니다. 너무 긴 시간 동안 배양을 시키면 inclusion body로 갈 확률이 커지기 때문입니다. 간단하게 먼저 37℃로 2hr induction을 한 후, 결과가 좋지 않을 경우에 25℃ overnight induction에 들어 갑니다.

6). 배양을 마친 cell을 원심분리 tube에 모아서 cell down을 시킵니다. 4,500rpm 10min~ 15min at 4℃로 해주면 됩니다. 그리고 상층액을 버린 후, pellet을 cold PBS로 resuspension 해준 뒤 다시 원심을 돌려 상층액을 버립니다. ※ 여기서 실험을 잠시 멈출 경우, 그 cell pellet을 -20℃에 보관합니다. 7). cell pellet을 적당량의 cold PBS 또는 cold lysis buffer로 resuspension해준 후, sonication 시킵니다. ※ 주의 : 항상 차가운 상태를 유지하여야 합니다. Sonication 시에도 ice 위에서 하도록 하여 protease의 활성을 약하게 만듭니다. ※ Sonication은 Ultra-sonicator로 할 경우, 그 과정에서 많은 열이 발생하게 됩니다. 일반적으로 1min정도 해주며, ice위에서 해주지 않을 경우, 그 고열로 인해 protein이 denature되게 됩니다. ※ Sonication 할 때의 cell volume도 중요합니다. Amesham phamacia에서 제공한 것을 보면 다음과 같습니다.

8). Sonication 시킨 sample을 12,000rpm for 30min at 4℃을 해줍니다.

9). pellet을 건드리지 않고 상층액 만을 새로운 tube안에 넣어줍니다. * 만약에 상층액을 옮기는 과정 중에 pellet이 조금 들어갔다면, 다시 원심을 돌려서 상층액만을 새로운 tube로 옮겨줍니다.

10). 적당량의 glutathione-Sepharose bead slurry을 PBS or lysis buffer한번 washing 해주어 bead를 equilibrium해줍니다. ※ Bead의 양은 다음을 참조하시면 됩니다. Reagent volume requirements for different protein yields (by Amersham Phamarcia)

11). cell lysis sample에 그 bead을 넣어준 후 rotator에 그 tube을 고정시키고 4℃에서 o/n 동안 회전시켜줍니다. 이 단계에서 GST or GST-fusion protein이 the bead에 binding되는 단계입니다.

12). binding이 끝난 sample tube을 간단히 spin down 시킨 후 상층액을 버립니다. 이 단계에서는 non-binding proteins을 없애주는 washing단계입니다. 상층액을 버린 후에 1ml의 cold PBS or lysis buffer included protease inhibitors를 넣어주고, 3~5분간 다시 4℃안에서 rotator을 이용하여 회전시켜 줍니다. 그리고 다시 간단히 spin down시킨 후, 앞서 말한 것을 3~5회 반복하여 줍니다. ※ 너무 많은 washing과 너무 적은 washing은 yield의 양과 질에 영향을 줄 수 있으므로 적절히 조절해 나가야 합니다. 13). 맨 마지막 washing할 때에 , 적정량을(1/2 or 1/5 of 총 부피)을 새로운 tube에 덜어줍니다. 나머지는 일단 glycerol을 섞어서 -20℃에 보관합니다. ※ -20℃에 보관할 때 절대로 bead가 얼어서는 안됩니다. 14). 새로운 tube에 있는 sample은 4X SDS-PAGE sample buffer을 넣어주어서 90~100℃에서 3~5분간 끓여줍니다. 이 단계에서 Bead와 붙은 결합이 끊어지게 됩니다. 그리고 SDS-PAGE를 다음과 같이 걸어줍니다.

※ 여기서 GST total은 Bead에 붙이기 전 lysis sample의 소량을 SDS-PAGE에 걸어준 것입니다. GST-fusion protein total도 마찬가지로 lysis sample의 소량을 걸어준 것입니다. 그리고 -alone은 bead에 binding후에 SDS-PAGE을 걸어 준 것입니다. 15). SDS-PAGE gel을 전기영동 한 후에, coomassive staining을 해주고, gel dry을 해줍니다. 그리고 나온 결과를 바탕으로 purification을 분석 발전된 전략을 세웁니다. 16). 그리고 다음 단계는 elution 단계 입니다. *이 단계는 모든 purificaiton조건을 만족스럽게 setting하고 나서 행하여지는 단계입니다. 이 단계 이후의 설명은 다시 washing 단계에서 시작하겠습니다. 17) Washing & elution 1. Washing에 사용할 lysis buffer를 준비하고 protease inhibitor를 섞어 놓습니다. Bead binding이 끝난 tube를 spin down 하여 bead를 down 시킵니다.

2. Pipette으로 상등액을 조심스럽게 덜어내어 버립니다. 이때 bead가 딸려 올 수도 있으므로 주의해야 합니다. Lysis buffer 1ml을 조심스럽게 pipette으로 넣은 후 살짝 resuspension 해주고 cold chamber에서 10분 동안 incubation 시킵니다.

3. 다시 원심을 돌려서 상등액을 제거하고 lysis buffer 1ml을 첨가하여 incubation 합니다.이 washing 과정을 4회 실시합니다. 4. Elution buffer를 준비하고 역시 protease inhibitor를 섞어 놓습니다. Washing이 끝난 bead를 spin down 후 상등액을 버리고 elution buffer 100㎕를 넣어 상온에서 10분 동안 incubation 시킵니다. Elution 후 spin down 해서 상등액을 새 tube로 옮깁니다. 충분히 elution이 될 때까지 반복적으로 실시합니다.

5. Elution을 통해 얻은 solution에는 원하는 단백질 외에 다른 물질들이 있습니다. 그 물질들을 없애고 원하는 단백질을 농축시키기 위해 dialysis와 ultrafiltration을 행해야 합니다. 18) Dialysis & ultrafiltration 1. Dialysis를 위해 buffer를 만듭니다. 보통 2회의 dialysis를 하고 한 번에 1.5L 정도의 buffer가 소요되고 이 buffer는 미리 만들어 4℃에 보관합니다. Buffer 조성은 해당 단백질을 사용할 실험에 쓰이는 buffer 조성과 동일한 것이 좋습니다. 그래야지 그 단백질을 사용하는 실험에서 buffer 조성이 변하지 않습니다. 2. Dialysis cassette를 준비합니다. 여기서는 Slide-A-Lyzer를 사용하도록 하겠습니다. Dialysis membrane은 hydration 과정을 거쳐야 합니다. 따라서 bouy에 cassette를 끼워서 buffer가 담긴 beaker에 30초 동안 담가둡니다. Membrane은 손이나 다른 곳에 닿지 않도록 주의합니다.

3. 이제 elution 시킨 sample을 주입해야 합니다. Sample은 syringe를 이용하여 cassette의 모서리에 있는 구멍으로 주입을 합니다. 이때 바늘이 완전히 들어간 상태에서 주입을 해야 합니다. 또한 바늘에 의해 membrane이 상하지 않게 조심해야 합니다.

4. Sample 주입 후에 cassette 내에 있는 공기를 완전히 빼냅니다. cassette를 다시 bouy에 끼워서 buffer가 담긴 beaker에 띄워 dialysis를 행합니다. 1차 dialysis는 4℃에서 4~5시간 정도하면 되고 2차 dialysis는 4℃에서 over night 합니다. 이때 stirrer를 이용하여 beaker 안의 buffer을 살짝 교반 시키는 것도 좋습니다.

5. Dialysis 시킨 sample은 적정 농도로 농축을 시키기 위해 syringe를 이용하여 membrane으로부터 빼내야 합니다. 먼저 약간의 공기를 cassette에 syringe를 이용하여 밀어 넣고 아래쪽 모서리에서 sample을 빼냅니다. 빼낸 sample은 새 tube로 옮깁니다.

6. 이제 ultrafiltration을 시킵니다. 여기서는 millipore의 microcon을 사용할 것입니다. Sample reservoir와 filtrate vial을 준비 하고 filter가 vial에 들어가는 방향으로 결합합니다.

7. sample을 reservoir에 넣습니다. 이때 들어가는 양은 500㎕가 최대량 입니다. 12000rpm으로 25℃로 원심을 돌리는데 시간은 실험자가 원하는 농도로 되도록 조절을 해야 합니다. 보통 12분 정도는 돌려야 합니다.

8. 농축된 sample은 회수를 해야 합니다. Filter 부분에 남아있는 sample을 회수하기 위해 reservoir를 filter 부분이 바깥으로 향하도록 vial에 끼우고 살짝 원심을 돌립니다.

9. Vial에 모인 농축된 sample은 새 tube로 옮깁니다. 농도의 확인은 SDS-PAGE 를 통해 하게 되는데 이때는 확실한 농도를 아는 standard 단백질을 같이 걸어주어야 합니다. BCA 정량을 할 수도 있지만 다른 단백질의 함유여부를 확인 할 수 없기 때문에 적절하지 못한 방법이라

Plasmid의 구성

Plasmid는 크게 다음과 같은 세 부분으로 구성되어 있습니다.

1) Replication origin

이 부분은 plasmid가 자가복제할 때 처음 인식하는 부위이므로 모든 plasmid에 꼭 필요한 부분입니다. 그림에서 보이는 ColE1 ori라고 씌여진 부분입니다.
다른 곳에서 설명할 기회가 없을 것 같아 여기에서 설명하는데, f1(+) origin이라는 것이 보이지요? 이것은 사실 plasmid의 origin of replication이 아니라 bacteriophage의 origin입니다. 이걸 여기에 삽입해 놓으면 이 plasmid가 때로는 bacteriophage처럼 행동하기도 합니다. Bacteriophage의 장점은 life cycle 중에서 single stranded DNA로 존재할 때가 있다는 것인데, 이런 성질이 유용할 때가 있습니다. 어느 쪽 strand가 single strand 상태로 존재하는가에 따라 f1(+) 혹은 f1(-) origin을 이용합니다.

2) Antibiotics resistance gene

이것은 항생제에 내성을 나타내는 유전자입니다. 대개는 ampicillin resistance gene이 들어 있는데, 이 경우 여기서 나오는 단백질은 그 유명한 beta-lactamase입니다. Amp^R이라고 씁니다. 때로는 kanamycin resistance gene을 쓰기도 하고, eukaryote expression vector에는 주로 neomycin resistance gene이 들어 있습니다.

3) Multiple cloning site(MCS)와 LacZ'

이 부위는 제한효소로 잘릴 수 있는 부위를 한꺼번에 모아놓은 부분입니다. 제한효소로 잘라서 다른 DNA를 삽입시킬 때 위에서 설명한 중요한 부분들이 같이 잘리면 곤란하겠지요. 그래서 다른 부분은 절대 잘리지 않고 이 부분에만 잘릴 수 있도록 열 몇가지 제한효소 절단부위를 인위적으로 조작해 놓은 것입니다. 이 MCS 부위는 길어야 100 - 150 bp 정도이며 앞 뒤 부분에 SP6, T3, T7 promoter 등이 붙어있게 됩니다. 이런 부위는 RNA를 시험관에서 만들거나 단백질 발현을 시킬 때, 그리고 DNA sequencing 같은 실험을 할 때 쓰이는 부위입니다. 여기에 써 있는 제한효소는 실험실에서 고추장 된장 간장 등에 해당하는 것으로 이름을 반드시 알아야 하겠습니다. 때로는 절단부위까지도 대개 외우고 있게 됩니다.

LacZ'는 꼭 필요한 것은 아니지만 대개는 있으며 반드시 MCS(multiple cloning site)를 포함하고 있습니다. 이 부분에 대해서는 나중에 자세히 설명하겠습니다.

항생제를 이용한 selection

Transformation한 후의 결과는 다음 세 가지 중의 하나로 생각할 수 있습니다.

1) Plasmid가 들어가지 않은 경우
2) Plasmid가 들어갔으나 plasmid에 원하는 gene이 들어가지 않은 경우
3) 원하는 gene이 포함된 plasmid가 들어간 경우

입니다.

Plasmid에는 antibiotics resistance gene이 포함되어 있으므로 항생제가 포함된 배양접시에서 plasmid가 들어가지 않은 cell은 사멸하여 colony를 생성하지 못합니다. 배양접시에 보이는 colony는 모두 plasmid가 들어가 있는 cell입니다.

아무리 transformation 효율을 높인다고 하여도 competent cell 중에서 DNA가 들어간 균은 아주 적습니다. 그러므로 이것들이 모두 colony를 형성한다면 그건 정말 끔찍한 일입니다. 그만큼 항생제를 이용하는 것은 옵션이 아닌 필수적인 것입니다.

그렇지만 이것으로 문제가 모두 해결되는 것은 아닙니다. 재조합 plasmid에 원하는 gene이 제대로 들어가 있는지 확인할 필요가 있습니다. 재조합되지 않은 그냥 plasmid가 cell 내에 들어가 있을 수도 있기 때문입니다. 위 그림에서 두번째와 세번째를 구분하는 것이 바로 다음에 설명할 LacZ를 이용한 color selection 입니다.

LacZ를 이용한 color selection

LacZ를 이해하기 위해서는 Lac operon이란 것을 알아야 합니다. 이는 박테리아에서 시행되는 유전자 발현 조절 기구입니다.

Lac operon은 E. coli가 lactose를 galactose와 glucose로 분해하는데 필요한 효소인 beta-galactosidase를 만드는 유전자입니다. 다음은 Lac operon이 동작하는 얼개입니다.

Lactose가 없을 때에는 불필요한 유전자인 beta-galactosidase는 생성되지 않습니다. 그 이유는 유전자의 앞쪽에 있는 inhibitor region에서 생성된 inhibitor가 promotor 영역의 operator 부분에 결합하여 RNA polymerase 가 활동하는 것을 방해하여 beta-galactosidase가 생성되지 않도록 하기 때문입니다.

그러나 lactose가 배지에 있으면 이 물질이 inhibitor와 결합하여 operator에서 떼어냅니다. 따라서 RNA polymerase가 잘 작용하여 mRNA를 만들고, beta-galatosidase를 만들면서 lactose를 분해합니다. 그 후 lactose가 다 분해되면 inhibitor가 다시 붙어 유전자는 turn off 될 것입니다.

이런 유전자 조절 기구를 실험에 이용하고자 하는 것이 바로 LacZ입니다. 이 부분을 plasmid에 삽입해 놓게 되는데, 이때 LacZ operon이 동작하고 있는가 확인하기 위해서는 IPTG와 X-Gal이라는 두 가지 물질을 사용합니다.

• IPTG는 LacZ gene inducer역할을 합니다. Lactose 대신 inhibitor와 결합하지만 분해되지 않습니다.
• X-Gal(5-bromo-4-chloro-3-indolyl-D-galactopyranoside)은 lactose 대신 beta-galactosidase에 의하여 대사되는 물질입니다. 일종의 변형된 galactose sugar로서 원래 무색이지만 beta-galactosidase에 의하여 대사되면 푸른색을 냅니다.

따라서 LacZ의 MCS에 DNA가 재조합되지 않은 박테리아의 colony는 LacZ가 제기능을 발휘하여 X-Gal을 대사시키므로 푸른 색이 되고, DNA가 재조합된 박테리아의 conony는 LacZ가 망가져서 기능하지 않아 X-Gal이 그대로 남아 있어서 흰색 colony가 됩니다. 이렇게 색깔의 차이로 DNA가 plasmid 에 들어가서 세포 내에서 증폭되어 기능하는지 알 수 있습니다. 아래 그림을 보면서 이해하시기 바랍니다.

그림에서 설명이 되듯이 plasmid에 들어가 있는 lacZ는 Lac operon의 일부입니다. Lac operon은 너무 커서 plasmid에 다 넣으면 못씁니다. 그래서 plasmid에서 작은 부분(alpha fragment)을 만들고, E. coli에서 나머지 부분(omega fragment)을 만들어 보완하면 완전한 beta galactosidase의 기능을 할 수 있게 됩니다. 이를 alpha complementation이라고 합니다.

사실, E. coli는 원래 beta galactosidase를 만들 수 있는 유전자를 가지고 있는 미생물입니다. 그러므로 정상적인 균이라면 plasmid가 들어가지 않아도 blue colony를 형성해야 하겠지요. 그래서 실험실에서 사용하는 균주는 거의가 Lac operon이 망가진, 위와 같이 omega fragment만을 만들 수 있는 mutant를 사용하는 것입니다.

Selection의 결과

지금까지의 과정을 정리하면 다음과 같습니다. Ampicillin과 X-Gal/IPTG시약으로 원하는 세포를 고르는 과정입니다.

Ampicllin 처리에 colony를 형성한 것 중에서 X-Gal/IPTG 처리로 흰색을 보이는 colony가 원하는 gene이 plamid에 재조합되어 들어가 있는 cell인 것입니다. 좀 복잡합니까? 이는 참으로 천재적인 발상인 것 같습니다. LacZ를 넣으면서 유전부호를 조작하여 multiple cloning site를 만든 것을 생각해보십시오.

Transformation process

LacZ를 이용하여 재조합 plasmid가 들어간 colony를 선택하기 위해서는 그림처럼 배양 접시에 X-Gal과 IPTG 시약을 넓게 바른 후 그 위에 세포를 골고루 펴서 발라줍니다. X-gal은 빛을 받으면 못쓰게 되므로 배지에 직접 첨가하는 방법은 그다지 좋지 못합니다.

Spreading을 하고 있는 장면입니다. 삼각 밀대를 어떻게 만드느냐고 묻는 사람이 많은데, 유리봉을 달구어 굽혀서 만듭니다. 실험실에서 별거 다하지요? 쇠로 된 걸 팔기도 합니다.

이렇게 해서 37°C 배양기에서 뒤집어 밤새 키우면 아래와 같은 결과를 얻을 수 있습니다.
왼쪽의 plate를 확대한 것이 오른쪽의 사진입니다. 약간 투명하게 보일 수도 있긴 하지만 이것은 아무래도 플래쉬를 터뜨린 결과인 것 같습니다.

덤으로 보여드리겠습니다. E. coli의 실물사진입니다. 요놈 덕분에 많은 일을 할 수 있게 되었죠.

오늘은 좀더 세부적인 이야기로 글리벡과 이를 둘러싼 미묘한 대결에 대해서 풀어보기로 하죠.

글리벡이 처음 사람들 입에 오르내린건 2000년 말이었습니다. 그 시작은 정보의 바다인 인터넷이었죠. 인터넷을 통해 만성 골수성 백혈병 치료제인 글리벡에 대한 소문이 퍼지면서, 환자들은 조기 시판을 호소하는 민원을 제기했고, 드디어 2001년 5월, FDA는 이례적으로 임상 2상만을 통과한 글리벡을 승인하여 판매를 허가했습니다. 이때 글리벡의 제조 회사인 노바티스는 월 최소 2400달러(약 300만원)를 받고 전세계에 팔겠다고 주장했습니다. 물가수준이나 국민소득을 고려하지 않고 전세계의 약가를 모두 동일하게 책정하겠다는 방침에 따라, 노바티스는 한국내 글리벡의 약값을 1알당 25,000원으로 공시했고, 이때부터 백혈병 환자들의 모임과 노바티스사의 줄다리기가 시작되었습니다.


글리벡에 대한 대립을 좀더 살펴보기 전에, 글리벡이란 과연 어떤 약인지 살펴보기로 하죠.


1960년, 아직 분자생물학이 본격적으로 태동하기 이전, 인간의 염색체가 46개라는 사실이 밝혀진 것도 겨우 4년전이었으니, 아직 이 분야는 깨어나기 이전의 시대였죠. 이때 펜실베니아 의대 병리학 교실의 종양 생물학자 노엘(Peter C. Nowell)과 헝거포드(Hungerford) 박사는 막연하게나마 악성 종양과 유전자의 변이에 연관이 있을 것이라고 생각하고 오늘도 염색체 연구에 열심이었습니다. 그러던 그는 어느날 현미경 하에서 이상한 것을 발견했죠. 만성 백혈병 환자의 염색체 중 22번 염색체의 길이가 정상인의 것보다 조금 짧다는 것이었죠. 그는 이 변이를 자신이 살던 도시 이름을 붙여 필라델피아 염색체라는 이름을 붙였는데, 만성 백혈병 환자의 경우 91%가 이 필라델피아 염색체를 가지고 있을 정도여서 이 염색체와 백혈병과 상관관계가 있을 것이라는 심증이 굳혀졌습니다. 그러나, 의외로 이 관계를 캐내는 것은 오래 걸려서 1973년에서야 이 필라델피아 염색체는 22번 염색체의 일부분과 9번 염색체의 일부분이 교차를 일으켜 자리바꿈을 하면서 형성된 결과라는 것이 밝혀졌습니다. 이 결과, 9번 염색체에 있던Abl(Abelsom oncogene)과 22번 염색체에 있는 Brc(Breakpoint cluster region)이라는 유전자가 결합해 Brc-abl이라는 형태가 되어서 이 유전자에 의해 만들어지는 타이로신 인산화 효소가 백혈병에 결정적인 작용을 한다는 것이 알려진 건1987년이었습니다. 이후 드러커 박사(글리벡을 만든 사람)가 시바가이기(Ciba-Geigy) 제약회사에서 본격적으로 연구를 시작한 것이 1993년이구요.(노바티스는 1996년 산도스(Sandoz)와 시바가이기가 합병해서 이루어진 회사입니다) 이후, 2001년에야 글리벡이 FDA 승인을 받았으니 최초의 원인이 밝혀진 이후, 결정적인 치료제가 나오기까지 40년이 넘는 세월이 걸렸던 것이죠.


이렇듯 제가 필라델피아 염색체에 대해서 길게 이야기하는 것은 글리벡은 바로 이 지점에 작용하기 때문입니다.
(글리벡(STI571)의 작용기작은 Brc-abl에서 생성된 물질에 결합하여 이후의 신호 전달 체계를 방해해서 만성 골수성 백혈병을 일으키는 것을 막습니다.)

위 그림에서 보듯이 글리벡은 필라델피아 염색체에서 생성된 이상 단백질에 작용해 그 단백질이 이후에 기능하지 못하도록 하여, 백혈병의 증상을 없앱니다. 글리벡의 임상 2상 실험 결과 만성기의 백혈병 환자 중 88%에게서 혈액학적 완전 관해(혈액 속에 비정상적인 백혈구가 존재하지 않는 상태, 병이 완전히 나은 것은 아니기 때문에 ‘완치’대신 ‘완전 관해’라는 단어를 씀) 현상을 보일 정도로 효과가 뛰어났습니다.


글리벡은 그 자체로도 항암제 역사의 새로운 장을 쓸 정도로 대단한 발견입니다. 기존의 항암제는 사실 암세포와 일반 세포를 구별하는 능력이 약해서, 암세포도 죽이지만 다른 정상적인 세포도 한꺼번에 공격하기 때문에, 항암제 치료를 받는 환자들은 구토, 무기력감, 전신 피로, 머리카락과 손발톱의 탈락 등 많은 부작용을 겪어야했습니다. 그래서, 어느 정도 체력이 뒷받침되어주지 않으면 항암제 치료로차 받을 수 없는 경우도 부지기수였습니다. 그러나, 글리벡은 정확하게 암세포에 특정적인 부분만 공격해서 정상 세포는 다치지 않고 암세포만을 공격하여 무력화시킵니다. 따라서, 이에 따르는 부작용을 급격히 줄였을 뿐 아니라, 치료 효과도 월등하게 뛰어나서 사람들이 초기에는 기적의 항암제라고 부를 정도였습니다. 그러나, 환자들의 기대도 잠시 지나치게 높게 책정된 약값과 완전치료제가 아니어서 약을 계속 먹어야 한다는 사실이 그들의 어깨를 짓눌렀습니다. 최초에 노바티스가 요구한 것은 1알당 25,000원이었습니다. 오랜 줄다리기 끝에 10%를 무상지원한다는 조건 하에 23,045원에 책정된 글리벡의 가격은 그래도 너무 높습니다. 또한 환자들을 더욱 절망하게 하는 건 글리벡은 완전 치료제가 아니라는 사실입니다. 위에서 이야기했듯 글리벡의 작용지점은 이미 필라델피아 염색체가 형성된 이후라서, 필라델피아 염색체 자체를 없애는 것은 아닙니다. 따라서, 백혈병의 완전 치료는 이론적으로는 골수 이식밖에는 없다고 알려져 있습니다. 글리벡은 한 두번, 또는 한 두달 먹어서 백혈병을 완치시킬 수 없습니다. 만약 그렇다면 약값이 지금보다 더 비싸더라도 참고 사먹을 수 있을 겁니다. 하지만, 골수 이식을 하거나 기타 다른 방법으로 백혈병이 완치될 때까지 글리벡은 매일매일 비타민을 먹듯 꾸준히 먹어야 하는 약입니다. 단발이 아닌 일상이 될 때, 23,045원이라는 약값은 대부분의 사람들에게 지나친 부담으로 다가옵니다.

여기서 등장하는 것이 인도의 제약회사 나코(Natco)의 비낫(Veenat)입니다. 비낫은 글리벡과 동일 효과를 가지면서도 가격은 2-3달러 수준으로 글리벡의 1/10에도 못미치는 값싼 가격이 매력으로 다가왔습니다. 인도는 2016년까지 지적재산권협정(TRIPS, Intellectual Property Rights, 특허, 의장, 문학, 예술 등 지적인 재산에 대한 독점적인 권리를 인정해 주는 것)의 이행의무에서 벗어나 있는데다가 인도 내에서는 제법 특허만 있을 뿐 물질 특허가 없는 것이 특징입니다. 물질 특허가 없다는 것은 같은 물질이라도 다른 경로를 통해서 만들어 낸다면 둘 사이에는 특허 침해가 없는 것으로 인정하는 것입니다. 따라서, 비낫은 글리벡과 성분은 거의 유사하나 다른 경로를 통해 만들어 졌기에 물질 특허가 없는 인도 내에서는 아무 문제없이 생산, 판매가 가능한 것이죠. (지금까지 인도의 제약 회사들은 이런 방식을 통해, 지나치게 비싼 선진국의 신약들을 값싸게 생산해온 주된 공급선이었습니다.) 이리하여 글리벡 공대위(glivec.jinbo.net)에서는 글리벡 약가 인하의 강제 실시 내지는 비낫의 수입 허가를 주장하고 있습니다.


특허의 보장과 생명의 권리. 이 문제는 지적재산권 협정에 제약 특허가 들어가면서부터 끊임없이 제기된 문제였습니다. 지적재산권협정은 특허라는 이름으로 신약의 독점기간을 20년으로 보장해주고 있기 때문에 시장 독점성이 보장되는 상황에서 약값은 가장 높은 가격으로 결정됩니다. 이때 기준이 되는 것은 북미, 유럽, 일본 등의 선진국시장으로 이들이 전체 제약시장의 82퍼센트를 점유하기 때문에 이들에게만 비싸게 팔아도 충분한 이윤을 남길 수 있기 때문입니다. 이들 시장에서 팔릴 수 있는 최고의 가격은 환자가 약을 먹을 수 있는 가격이 아니라 제약회사의 이익을 최대로 할 수 있는 가격이기에 문제가 됩니다. (예를 들어, 대표적인 불치병으로 불리는 에이즈는 현재 여러가지 약제를 섞어 사용하는 칵테일 요법으로 환자의 생명을 10년이상 연장시킬 수 있게 되었습니다. 이 칵테일 요법에 사용되는 돈은 년간 1만달러 정도인데, 대부분의 에이즈 환자들이 밀집해있는 아프리카 여러 나라들의 평균 GNP는 1500달러를 밑돕니다. 그들에게 있어 에이즈 치료제는 정말 꿈속의 약이나 다름없답니다)


사실 노바티스가 환자들에게 10%의 무상 지원을 제시하면서도 약값을 내리지 않는 이유는 한국시장에서 어떠한 이익을 얻기 위해서가 아닙니다. 한국 시장은, 특히나 만성 골수성 백혈병 시장은 매우 작습니다. 만성 골수성 백혈병은 10만명당 1명씩 발병하는 희귀질병으로 우리나라의 환자 수는 500여명입니다. 전세계를 상대로 장사를 하는 노바티스의 입장에서 보면 사실 무시해도 좋은 작은 시장입니다. 그런데도 불구하고 그들의 입장이 강경한 것은 전세계시장을 공략하기 위한 속셈으로 전세계 약가통일, 의약품 특허권의 강화라는 다국적제약자본의 이윤 창출과 직결되기 때문입니다. 그에 의거하면 미상공회의소와 유럽연합상공회의소가 ‘한국의 복지부가 선진 7개국의 평균가에 근거한 약값결정기준을 완전히 무시하고 혁신의약품에 대한 공격을 강화하고 있다’며 노바티스를 방어하고 나서는 것도 같은 이유에서입니다. 노바티스가 스위스와 미국의 약가를 근거로 한국의 글리벡 약가를 제시했듯이 같은 방법으로 40개국이 넘는 곳에서 글리벡 가격은 2만 5천 원 안팎에서 결정되었습니다. 한국의 약값이 2만 5천 원에서 대폭 하락할 경우에 전세계 곳곳에서 항의가 빗발칠 것이고, 비싸게 책정된 곳에서는 약값이 더 싼 나라를 찾아 수입을 추진할 것이기 때문에 엄청난 이윤이 걸려 있어 아무리 환자들이 목숨을 걸고 눈물겨운 투쟁을 시도하더라도 노바티스 역시 쉽게 물러서지 않을 태세입니다.


오늘은 여기까지입니다. 글리벡이 어떤 경로로 작용하는지 무엇이 문제인지에 대한 대략적인 고찰이었는데요, 다음주에 한 번 더, 이 문제를 다루겠습니다. 신약 개발은 현재 많은 사람들을 질병에서 해방되게 해주겠다는 이상적인 목표보다는 제약 회사의 이윤을 최대로 창출해낼 수 있는 질병에 집중되는 경향을 보이고 있습니다. 다음주에는 그 문제와 함께 노바티스에 대해서 좀더 얘기해보기로 하지요.



_출처 : 하리하라님의 과학 블로그

Imatinib는 항암물질로 스위스의 노바르티스(Novartis)사가 이것을 주성분으로 하는 만성 골수성 백혈병(CML) 및 위장관 기저 종양(GIST)의 치료제(상품명 Gleevec)로서 판매하고 있다. 기존 항암제와 다르게 부작용이 탁월하게 억제된 약제이며 만성 골수성 백혈병에 대해 우수한 완해효과를 보인다.

이 gleevec은 만성 골수성 백혈병 치료제인 글리벡이 급성 백혈병 치료에도 효과가 있다는 연구결과가 나왔다.

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백혈병의 임상양상은 질환의 유형과 침법된 세포의 성질에 따라 다양하다. 임파구성백혈병은 임파계 혈액세포가, 골수성백혈병은 골수계 혈액세포가, 그리고 만성 골수성백혈병은 성숙기에 있는 세포가 변이해서 발생하며 급성 골수성백혈병은 비교적 초기 단계의 조혈과정에서 분화를 시작하는 골수계 모세포의 장애로 초래된다.



3. 백혈병의 공통 증상

* 외형과 느낌

- 창백, 빈혈증세 - 피로감 또는 피곤함 - 항생제로도 조절되지 않는 감염 - 몸살 기운

- 오한 또는 고열 - 호흡곤란 - 체중감소 -비장비대



* 출혈

- 경미한 손상후 과도한 출혈

- 경미한 외과적 처치후 과도한 출혈 (이빨을 뽑을경우)

- 멍이 쉽게 듬

- 검푸른 출혈반점. 자반

- 붓고, 쉽게 출혈되며, 보라빛의 잇몸

- 비 출혈(코피)

- 월경 이상(월경과다,월경주기이상 등)

- 혈뇨 또는 혈변



* 골/관절통

- 특히 늑골과 흉골(가슴뼈)



* 드문 증상

- 임파선 종대 또는 부종

- 두통, 복시(물건이 둘로 보이는 현상)

배지명		특징
Alpha MEM (MEM, Alpha Modification)		MEM의 성분에 아미노산, 비타민 등이 추가로 첨가되어 있어 동물세포의 DNA 형질전환에 유용.
BME (Basal Media Eagle)		1950년대 Harry Eagle가 개발하여 HeLa 세포 배양에 사용. 세포성장에 필요한 필수 영양분 및 무기염류와 비타민류에 대한 연구의 결과로 얻어진 배지로 현재 널리 사용되는 MEM과 DMEM의 기본조성이 된 배지
DMEM (Dulbecco's Modified Eagle's Media)		BME의 변형된 형태 중 하나로 가장 널리 사용. BME에 비해서 아미노산이 4배 정도 많고 ferric nitrate가 더 첨가되어 있음.
F-12 Nutrient Mixtures (Ham's F12)		CHO(Chinese hamster ovary)세포 클론 증식용으로 1960년대에 Ham, R.G.가 개발. DMEM/F-12(DMEM과 Ham's F-12를 1:1로 혼합)는 다양한 세포의 초대배양에 적용하는 무혈청 배지로 사용.
IMDM (Iscove's Modified Dulbecco's Media)		DMEM의 변형된 형태. lymphocyte와 hybridoma 세포 배양에 많이사용.
M 199 (Media 199)		EBSS(Earle's balanced salt solution)과 다수다량의 아미노산, 비타민, 성장인자, 지질복합체가 포함되어 있음. 혈청을 첨가하여 다양한 세포주의 배양에 사용.
McCoy's 5A Media		기본 조성은 BME와 유사하나 아미노산과 비타민이 M 199 수준으로 첨가되어 있음.
MCDB Media		low protein 또는 무혈청 배양을 위해 개발된 배지. 각 MCDB배지는 특정 세포에 맞도록 개발되어 있음.
MEM (Minimum Essential Media Eagle)		BME에 비해서 아미노산의 농도가 더 높고 CO2/NaHCO3의 완충 작용을 위해 Earle's salts를 포함하고 있음. 세포 종류에 따라서 비필수아미노산이 더 첨가된 배지와 Earle's salts 대신 Hank's salts가 포함된 배지를 사용하기도 함.
RPMI 1640		부유 배양이 필요한 혈구세포를 in vitro에서 장기간 배양하기 위해서 개발. Rosewell Park Menorial Institute에서 개발되어 RPMI라고 명명. 부유하는 세포를 배양하는데 널리 사용.

Tissue culture         vessels	Growth area (cm2)	Medium volume (ml)	*1Xtrypsin or    1Xtrypsin-EDTA solution Volume (ml)
Microwell plates
96 well	0.32	0.3	0.3
24 well	2.0	0.5 - 1.0	0.5
12 well	3.8	1 - 2	1
6 well	9.6	2	1
Culture Dishes
35 mm	9.6	2	1
60 mm	21	5	2
100 mm	55	10	5
150 mm	145	20-30	8
Flasks
25 cm2 (T-25)	25	5-10	2
75 cm2 (T-75)	75	15-30	5
175 cm2 (T-175)	175	30-50	8
225 cm2 (T-225)	225	50-70	15
Roller Bottles
1250 ml	490	100-200	-
2200 ml	850	100-250	-
4900 ml	1750	100-500	-

* 1X trypsin: contains 0.25% porcine trypsin (1:250)

* 1X trypsin-EDTA: contains 0.05% porcine trypsin (1:250) and 0.53 mM EDTA·4Na

 

SNP(Single Nucleotide Polymorphism;단일 염기 변이)

왜 우리집안 사람들은 나이가 갓 서른만 넘게 되면 다른 집안사람이 육십은 되어야 날만한 흰머리가 나고 또 나이가 서른도 안되었는데 머리가 빠져 고민을 해야하나? 어떤 사람은 간염에 걸리고도 쉽게 치유가 되는 반면 또 어떤 사람들은 간경화, 간암과 같은 치명적인 질병으로 진행되는데 왜 그럴까? 한약이던 양약이던 그 효과가 사람마다 다른 것 같은데 그건 왜 그럴까? 왜 저 집안 사람들은 대체적으로 다른 집안사람보다 잘생기고 머리도 좋아 자식들이 모두 일류대학을 쉽게 들어가는데 그 비밀이 어디에 있을까?

이러한 질문의 고리는 막연하지만 어린 시절부터 나이가 들어서까지 뚜렷이 대답하기 어려운 의문점중의 하나이었다. 이에 대한 대답은 "개인적 다양성"과 "유전"이라는 것이 될 것이다. 즉 개인적 다양성이 유전되어 부모의 특징이 자식에게 물려지는 것이다.
그렇다면 이 개인적 다양성을 결정하는 것은 무엇일까? 이에 대한 대답은 모두가 알고 있듯이 서로 가지고 있는 유전자가 다르다는 것이다. 그렇다면 개인에 따라 유전자가 어느정도 다를까? 언뜻 생각에는 상당한 많은 부분이 다를 것 같은데 서울에 있는 김갑동씨의 유전자와 아프리카 적도의 외딴 섬에 있는 원주민의 유전자는 대부분 같고 단지 0.01% 미만의 유전자구조가 달라서 김갑동씨는 훤칠한 키와 명석한 두뇌를 가지고 있는 멋진 한국인이 되고 적도에 사는 원주민은 그 0.01%의 차이에 의해 왜소한 체격에 까만 피부색을 가지는 흑인이 되는 것이다. 실제로 사람과 원숭이의 차이조차도 아무리 넉넉히 잡아도 2%를 넘지 못한다고 한다.

그렇다면 이런 개인적 유전적 다양성의 실체는 무엇인가? 바로 SNP(단일염기다형; Single Nucleotide Polymorphism)인 것이다. SNP(스닙[snip]으로 발음하기도 함)는 인간유전체에서 1000개의 염기마다 1개꼴로 나타나는데 이에 의하여 개인의 유전적 다양성이 발생한다. 즉 DNA사슬의 특정 부위에 어떤 사람은 A(아데닌)를 가지고 있는 반면 어떤 사람은 C(씨토신)를 가지고 있는 것이다. 이런 미세한 차이(SNP)에 의하여 각 유전자의 기능이 달라질 수 있고 이런 것들이 상호 작용하여 서로 다른 모양의 사람을 만들고 서로 다른 질병에 대한 감수성의 차이를 만들어 낸다. 즉 간염에 걸리는 사람과 걸리지 않는 사람간의 유전적 차이를 찾아낼 수 있다면 무슨 이유에서 간염에 대한 감수성이 달라지는지의 기능을 알아낼 수 있게 된다. 그렇게 된다면 이를 이용하여 간염의 예방이나 치료에 사용되는 약품을 개발할 수 있을 것이라는 것이 인간유전체 연구의 궁극적인 목적인 것이다.

이에 세계적인 거대 제약회사들과 지놈 연구기관들은 앞으로 SNP가 신약개발의 원천적인 정보를 제공할 수 있다고 판단하고 "The SNP Consortium(TSC) "을 형성하여 공동으로 인류의 영원한 이상이었던 무병장수의 꿈을 앞당기려 SNP 연구에 집중하고 있다. 이들은 각각의 제약회사나 연구기관이 그들 나름대로의 SNP 연구를 진행하여 그들만의 신약개발에 이용할 수도 있었겠지만 그것보다는 공동으로 SNP연구를 진행하여 보다 빨리 이에 대한 해답을 얻는 것이 낫다는 판단을 한 것이다. 이 SNP Consortium의 데이터 베이스에는 이미 30만개(2000년 8월)에 이르는 SNP가 공개되어 있어 참여한 제약회사, 연구기관 뿐 아니라 세계의 모든 연구자들이 손쉽게 이용할 수 있게끔 되어 있다.
그러나 수많은 SNP가 개발되어 있다고 하더라도 SNP 자체만으로는 아무런 의미가 없는 것이다. 즉 SNP를 비교분석할 대상이 없다면 이는 무용지물인 것이다. 이미 외국의 제약회사나 연구기관들은 그들이 많이 가지고 있는 심장병, 치매, 에이즈 등등의 질병에 대한 비교 대상(환자의 DNA 및 임상자료)을 확보하고 어떤 SNP가 해당질병과 관련되어 있는지를 연구를 진행 중에 있으며 이에 대한 유전자 특허 확보에 심혈을 기울이고 있는 상황이다. 이미 미국, 유럽 및 일본의 유전자특허에 대한 기준은 단순한 유전자의 염기순서나 SNP자체만으로는 특허을 인정하지 않는 것으로 정리되었고 질병과의 상관관계가 증명되어야만 이를 인정하는 것으로 확정되어 있다. 이에 선진국들은 SNP는 모두가 공동으로 개발하고 이를 이용하여 각 주요질병에 대한 연구는 각자가 진행하며 누가 빨리 얼마나 많은 유전자특허정보를 개발하느냐에 경쟁을 하고 있는 상황이다.

1) 질병의 유전적 이해
SNP의 기능을 구명하는 것은 질병을 이해하고 예방하며 치료하는 방법에 거대한 변화를 일으킬 것이다. 건강한 사람과 질환을 가지고 있는 사람들간의 수많은 SNP의 차이가 연구되고 있고 이는 질병에 대한 유전적 소양을 이해하는데 큰 도움이 될 것이며 유전자진단이 가능하게 하여 질병의 예방에 획기적인 정보를 제공할 것으로 기대되고 있다.

2) 맞춤약물의 개발
가장 기대되는 분야로는 각 개인의 유전적 조성에 따라 각 개인에게 보다 효율적인 약품을 적용하는 맞춤의학이라 할 수 있다. 현재 대부분의 약물은 평균적인 사람에게 맞추어져 있다고 하나 평균적인 인간이란 존재하지 않는다. 우리 인간은 약물반응을 포함해서 많은 면에서 다른데 각기 다른 유전적 소양에 의하여 같은 약품이라도 그 효능이 다르게 나타남으로 해당 약품에 관여하는 유전적 특징을 밝혀 낼 수 있다면 개인별로 보다 효과적인 처방이 가능하여 질 것이다.

3) 신약개발 정보 제공
특정 기능을 가지는 SNP에 대한 유전자정보가 개발되면 이는 SNP 기능을 응용한 신약개발이 가능하게 된다. 실제로 현대의 흑사병이라 불리는 에이즈를 대상으로 한 연구결과를 예로 들면 유럽의 일부 사람들은 에이즈 바이러스에 선천적으로 감염되지 않는다. 따라서 이 특정 유전적 부류의 사람들이 왜 에이즈 바이러스에 감염되지 않는지를 밝힐 수 있다면 이 정보를 이용하여 에이즈 예방약을 개발할 수 있지 않을까 하는 것이다. 이 부분이 실제로 많은 거대 제약회사들이 엄청난 투자를 하면서 기대하고 있는 분야이며 인간유전체사업의 궁극적인 목적이자 엄청난 경제적 가치를 기대할 수 있는 분야라 할 수 있다.

SNP의 분석에는 다양한 방법이 이용되고 있으나 크게 두가지 방향으로 정리될 수 있다.

1) 여러 시료에 대한 한정된 수의 SNP 분석
2) 한정된 시료에 대한 여러 SNP 분석

지금까지 개발되고 이용중인 대부분의 방법은 여러 시료(수백-수천)에 대한 한정된 수의 SNP 분석이 그 주류를 이루어져 왔다고 할 수 있다. 아직은 실용화 단계에 있다고는 할 수 없지만 DNA array를 이용한 SNP 분석은 한 시료에 대한 여러 SNP(수천-수만)를 동시에 분석할 수 있는 방법으로 머지 않은 장래에 가능해지리라 기대되고 있다.

현재까지 개발된 주요 SNP 분석법은 다음과 같다.

1. SSCP(Single Strand Conformation Polymorphism) 2. PCR-RFLP(Restriction Fragment Length Polymorphism) 3. Allele-specific PCR(AS-PCR) 4. GC-tail primer를 이용한 Tm-shift genotyping 5. DASH(Dynamic allele-specific hybridization) 6. TaqMan(5’-nuclease assay) 7. Molecular Beacons 8. OLA (Oliognucleotide ligase assay) 9. Invasive cleavage of oligonucleotide probes(Invader Assay) 10. Pyrosequencing 11. Single Base Extension 12. Fluorescence Polarization 13. Matrix Assisted Laser Desorption/Ionization Time-of-Flight(MALDI-TOF) - Mass Spectrometry

[펌] 출처 : http://www.snp-genetics.com