BioloGical BloG

1) pGEX vector
GST-recombinant protein의 제작에 있어서 쓰이는 vector는 pGEX vector입니다. 이 벡터의 앞부분에는 GST을 coding하고 있는 sequence가 있습니다. 기본적으로 모든 pGEX vectors는 발현 조절 promoter로서 tau promoter가 있으며, 이 promoter는 Isopropyl β-D thiogalactoside (IPTG)에 의해 발현 유도가 됩니다. 게다가 모든 pGEX vector에는 tau promoter말고 내부의 lacIq gene에 의해서도 조절이 되는데, 이 lacIq gene의 산물은 tau promoter의 operator부분에 붙어 repressor의 역할을 하고, IPTG에 의해 유도 될 때까지 insert된 유전자의 발현을 막고 있어, 결과론 적으로 insert의 over-expression의 밀접하게 조절하는 격이 됩니다.

pGEX vector는 총 10개의 종류가 있으며, 크게 분류하자면 4가지의 vectors (pGEX-P, pGEX-T, pGEX-X, pGEX-2TK)가 있습니다. pGEX vectors의 기본적인 특징은 위에서 언급한것과 같지만, 나중에 GST을 제거하여 insert protein만 얻을 때 필요한, cleavage site의 종류가 다릅니다. (그림 참조)

2) The Host
비록 pGEX vector을 가지고 cloning과 expression에 사용할 수 있는 E.coli host strains을 다양하지만, full-length fusion proteins의 발현을 최대화 할 수 있고 더 안정된 특별히 제작된 stains이 있습니다. 특히 cytoplasmic protease gene products로 알려진 Lon, OmpT, DegP or HtpR들이 없는 균주들은 그 균주로 부터 proteolytic degradation의 영향들을 최소화 함에 따라 그 fusion proteins의 발현에 도움을 줄 수 있습니다.
※ Not protease-deficient을 가진 E.coli 균주를 사용할 경우 fusion protein의 proteolysis의 결과를 줄 수 있습니다.
Omp 와 Lon protease production이 결핍되어 있는 균주인 E.coli BL21은 GST fusion protein의 High level expression을 나타내는 균주로 특히 현재까지 선택 되어지고 있습니다.
※ BL21은 Transform이 잘 않되게 때문에 다른 균주(cloning and maintenance of vector에 많이 쓰이는 균주 e.g. JM105)을 사용할 수 도 있다. 하지만, gene의 발현에 있어서의 연구는 BL21 균주가 선택적으로 쓰이고 있습니다. 그리고, pGEX plasmid의 증폭에 있어서 recA1 allele을 가지고 있는 E.coli strain은 사용하지 말아야 합니다. 그들은 plasmid DNA안에 rearrangements or deletions을 야기 할 수 있다고 보고되고 있기 때문입니다.

전체적으로 간략하게 보면, 일단 insert DNA가 들어가있는 pGEX vector을 먼저 sequencing analysis을 거쳐 정확하게 sequence flame이 맞는지 확인 합니다. 확인된 그 plasmid를 BL21에 transformation합니다. 그 transformed BL21을 적당히 키운 상태에서 IPTG을 넣어서 GST-fusion (GST-recombinant) proteins을 발현 시켜줍니다. 발현 후에 그 cell을 sonication시켜서 cell 내용물들이 buffer안으로 녹아 나오게 하고, pellet은 제거합니다. 그리고 그 상층액만을 모와서 glutathione-sepharose beads을 넣어주어서 GST-fusion proteins을 붙게 한 후, 침전시켜서 그 침전 된 것을 모아서 elution하여 GST-fusion proteins만을 모으면 됩니다. 더 나아가 cleavage단계를 거치면 원하는 recombinant proteins만을 얻을 수 있습니다. (아래 그림 참조)

자. 이제부터 실험하는 사람이 어떠한 전략을 짜느냐가 중요합니다. Recombinant Proteins purification은 실험과정, 실험환경 그리고 실험원의 차이에 따라서도 결과가 다르게 나올 수 가 있기 때문입니다. 한번에 성공하기 보다 실험을 하면서 자신 스스로 set-up을 하나씩 해나가면서 실험을 해야 합니다.
Fusion-protein purification의 최대의 적은 inclusion bodies입니다. 하지만, inclusion bodies을 적을 로만 생각할 것이 아니라, 적을 알면 내가 이기듯 inclusion이 생기는 원인을 자세하게 분석하면서 실험 조건을 변화시켜 최종적으로 Optimizing for soluble expression을 정하는 것입니다. 일반적으로 High-level expression of foreign fusion proteins in E.coli은 종종 inclusion bodies을 형성 할 수 있습니다. Inclusion bodies는 folding intermediates에 실패되어 불용성으로 뭉치고 뭉친 것들입니다. Inclusion bodies가 생기면 거부보단 그 결과를 받아드리되, 그 proteins을 solubilize와 refold 되도록 전략을 발전시켜야 됩니다. 다양한 배양의 parameters을 한가지 또는 여러 가지를 바꿔가면서 실험에 투자하면 soluble fraction에서 non-degraded fusion protein의 좋은 효율을 제공할 수도 있습니다. 간단하게 그 투자할 단계는:
* 배양 온도를 20℃와 30℃사이로 낮춰보는 것입니다.
* rpm을 높여 aeration을 증가시킵니다.
* Induction 조건을 바꿉니다.
일반적으로, 낮은 세포들의 농도(A600=0.5)에서 Induction은 보통 soluble form과 함께 fusion protein의 좋은 수율을 가져옵니다. 하지만 특별한 경우는 세포를 높은 세포 농도로(>1A600 unit) 키우는 것이 이득이 될 수 도 있습니다. 세포를 높은 농도로 키워가고 동시에 IPTG가 넣지 않던가 IPTG의 농도를 0.1mM까지 낮춰가면서 실험을 해봅니다. 물론 수율은 작아지겠지만, fusion protein을 좀더 intact form으로 proteins을 얻을 수 있게 됩니다.
※ 만약 the plasmid를 E.coli strain BL21가 아닌 다른 host에서 증식을 했다면, fusion protein의 발현을 위해서는 BL21으로 이동시켜 줍니다.
※ 각 중요한 단계들에 소량의 sample의 남겨둡니다. Induction 전도 포함하고, Induction 후에 다양한 시간대 별로 그리고 purification 단계들 동안에도 남겨두어서 growth 와 purification methods을 분석하시면 됩니다. 일단 분석이 완료되면, 그 positive clones의 glycerol stocks을 준비하고 -80℃에 저장합니다.
Fusion proteins purification 시 생각해 볼 control points이 있습니다. 아래 그림을 참조하면서 보시면, IPTG의 양, 발현시 배양 온도, fusion protein의 성질, induction 시간, 얼만큼 배양시킬 것과 Handling을 생각할 수 있습니다.
그리고 그러한 단계들을 거치면 또 다시 주의와 결정해야 될 것이, sonication의 시간, lysis시킬 volume, 적당한 lysis buffer의 선택과 그리고 4℃로 유지하여 protease로부터 proteins이 분해되는 것을 막는 것 등 입니다.

Controls points를 지나서 다음으로 중요하게 생각할 점들이 있습니다. 아래의 그림을 참조하시면 됩니다. 일반적으로 glycerol stock clone이나 agar medium에 있는 clone들을 이용하여 expression of fusion protein을 할 때, colony을 바로 접종하여 원하는 농도에서 IPTG을 넣는 것 보다는 seed culture을 한번 해주는 것이 일반적 입니다. 이렇게 하면 장점은 같은 colony로부터 여러 조건들을 변화시킬 수 있는 실험을 할 수 있다는 것과, 한번 seed을 해주고 본 접종에 들어가면 그만큼 균들의 상태가 좋아 진다는 것이 됩니다. 그리고 IPTG의 농도입니다. 여러 참고문헌 에서는 IPTG의 농도를 결정시에 0.1mM~1.0mM까지 넣어준다고 합니다. 하지만 실험에 사용할 때는, 앞서 설명한 봐와 같이 IPTG농도를 적은 상태에서 발현이 잘 되도록 조건 잡는 것이 유리합니다. 마지막으로 중요한 점은, 배양 온도 입니다. 실질적으로 배양을 어떻게 시키느냐에 따라 Inclusion body의 유무와 양이 결정된다는 것을 가장 기본적으로 염두 해 두어야 할 사실 입니다. 가장 좋은 조건은 37℃가 되겠지만, inclusion body가 생기면은 일단 온도를 낮춰가면서 조건을 잡아가시면 됩니다. 일반적으로 fusion protein의 크기가 크면 클수록 낮은 온도에서 배양을 한다고 합니다.

우리가 분리하고 하는 단백질의 성질을 분석하는 것도 매우 중요합니다. 일반적으로 GST는 26kDa입니다. 예를 들어, GST을 tagging하고 있는 fusion proteins 자체가 14~15kDa이라합시다. 일반적으로 이런 크기의 proteins은 purification하는데 보통 손쉽게 할 수 있습니다. 하지만, 그렇지 않는 경우가 있습니다. 그것이 바로 nuclear proteins입니다. 이 proteins들은 DNA에 붙는 단백질이라는 사실을 잊고서 purification하면은 inclusion body에 좋은 효율을 못 얻을 것입니다. Sonication시에는 세포 안의 chromosome들이 짧은 단편으로 조각이 나게 됩니다. 일반적으로 DNA는 pellet으로 가게 됩니다. 그럴 경우 nuclear proteins에도 그런 DNA조각들이 붙게 되어 pellet으로 가게 됩니다. 그리고 크기가 큰 proteins일수록 발현을 시키는데 어렵습니다. 그리고 발현이 되었더라도 큰 단백질이라 박테리아 세포 안에서는 그것을 불용성으로 되게 만들어 버립니다. 또한 단백질의 기본을 이루고 있는 amino acid sequences을 바탕으로 2차 구조는 그것의 solublity에 영향을 줄 수 있습니다.

Cell sonication후에는 우리가 원하는 단백질을 포함 여러 단백질도 나오게 되고 그중에는 protease도 나오게 됩니다. 이런 상황에 있어서 그런 protease의 action을 저해 시키기는 것은 가장 기본적으로 실험할 때 지켜야 할 상황입니다. Protease의 활성을 저해 시키기 위해 모든 과정을 ice 위에서 하는 것도 그 이유이며, 적당한 protease inhibitor을 첨가 해줍니다. 그리고 Sonication 과정에서도 잘못된 sonication은 단백질을 denature시키기 되며 결과론 적으로 insoluble화 됩니다. 그리고 lysis buffer 조성에 DTT가 들어 가게 됩니다. DTT는 항상 모든 단계에서 1mM로 유지시켜주어서 Protein-Protein aggregation을 막아서 inclusion body을 형성을 억제해 줍니다. 그리고 inclusion body는 제대로 folding이 되지 않은 것들이 포함되어 있어서 배지에 2% ethanol을 첨가해주면 세포내의 chaperons이 증가하게 되어 proteins의 folding이 증가됩니다. 물론 에탄올로 인해 배양 속도는 저하됩니다.

2). 배양시킨 agar 배지로부터 한 개의 colony을 골라 3ml medium + Amp에 접종합니다. 이단계가 seed culture입니다. 그것을 shaking incubator에서 37℃로 하루 배양합니다. 그리고 본 접종에 필요한 배지의 양을 정한 후, 삼각플라스크에 그 배지를 제조 후, Autoclave살균 시킵니다.

3). 살균된 medium에 Ampicillin을 넣은 후, 1:1000 or 1:500 or 1:100으로 접종합니다.
※ 여기서 pGEX만 들어간 BL21도 동시에 키워야 합니다. GST의 발현과 비교하기 위해 서입니다. 즉 GST alone과 GST-fusion proteins을 동시에 purification합니다. 처음 하시는 분은 일단 GST purification에 먼저 set-up을 한 후, GST-fusion protein purification을 들어갑니다.
4). 그 cells을 OD(A600=0.4, 0.6, 0.8)등으로 키웁니다.
* 즉 IPTG을 넣기 전의 cells의 최적 밀도를 정합니다. 표준은 0.4값에서 IPTG을 넣어서 induction하지만, 여러 OD값에서 접종을 하여서 자신의 실험에 맞은 최적 조건을 잡아 가야 합니다.
5). IPTG을 0.1mM~1mM로 넣고, 배양(즉, Induction)을 시킵니다.
* IPTG의 농도도 gene expression에 영향을 줍니다. IPTG는 reversible하기 때문에 저 농도에서도 충분히 발현된다는 것을 알고, 일반적으로 0.5mM이하로 induction 조건을 잡습니다. 그리고 배양온도도 중요합니다. 일단 먼저 37℃로 배양을 시킵니다. 후에 실험한 결과 inclusion body로 간다면 온도를 일단 25℃로 낮춰서 배양합니다. 어느 실험이건 먼저 37℃을 기준으로 실험을 해야 합니다. 37℃로 induction시키면 그만큼 배양시간이 1~2시간 정도로 짧게 되지만, 25℃이하는 일반적으로 overnight induction을 하기 때문에 시간상으로 1day을 절약할 수 있기 때문입니다.
그리고 배양 시간도 영향을 줍니다. 너무 긴 시간 동안 배양을 시키면 inclusion body로 갈 확률이 커지기 때문입니다. 간단하게 먼저 37℃로 2hr induction을 한 후, 결과가 좋지 않을 경우에 25℃ overnight induction에 들어 갑니다.

6). 배양을 마친 cell을 원심분리 tube에 모아서 cell down을 시킵니다. 4,500rpm 10min~ 15min at 4℃로 해주면 됩니다. 그리고 상층액을 버린 후, pellet을 cold PBS로 resuspension 해준 뒤 다시 원심을 돌려 상층액을 버립니다.
※ 여기서 실험을 잠시 멈출 경우, 그 cell pellet을 -20℃에 보관합니다.
7). cell pellet을 적당량의 cold PBS 또는 cold lysis buffer로 resuspension해준 후, sonication 시킵니다.
※ 주의 : 항상 차가운 상태를 유지하여야 합니다. Sonication 시에도 ice 위에서 하도록 하여 protease의 활성을 약하게 만듭니다.
※ Sonication은 Ultra-sonicator로 할 경우, 그 과정에서 많은 열이 발생하게 됩니다. 일반적으로 1min정도 해주며, ice위에서 해주지 않을 경우, 그 고열로 인해 protein이 denature되게 됩니다.
※ Sonication 할 때의 cell volume도 중요합니다. Amesham phamacia에서 제공한 것을 보면 다음과 같습니다.

9). pellet을 건드리지 않고 상층액 만을 새로운 tube안에 넣어줍니다.
* 만약에 상층액을 옮기는 과정 중에 pellet이 조금 들어갔다면, 다시 원심을 돌려서 상층액만을 새로운 tube로 옮겨줍니다.

10). 적당량의 glutathione-Sepharose bead slurry을 PBS or lysis buffer한번 washing 해주어 bead를 equilibrium해줍니다.
※ Bead의 양은 다음을 참조하시면 됩니다.
Reagent volume requirements for different protein yields (by Amersham Phamarcia)

11). cell lysis sample에 그 bead을 넣어준 후 rotator에 그 tube을 고정시키고 4℃에서 o/n 동안 회전시켜줍니다. 이 단계에서 GST or GST-fusion protein이 the bead에 binding되는 단계입니다.

12). binding이 끝난 sample tube을 간단히 spin down 시킨 후 상층액을 버립니다.
이 단계에서는 non-binding proteins을 없애주는 washing단계입니다. 상층액을 버린 후에 1ml의 cold PBS or lysis buffer included protease inhibitors를 넣어주고, 3~5분간 다시 4℃안에서 rotator을 이용하여 회전시켜 줍니다. 그리고 다시 간단히 spin down시킨 후, 앞서 말한 것을 3~5회 반복하여 줍니다.
※ 너무 많은 washing과 너무 적은 washing은 yield의 양과 질에 영향을 줄 수 있으므로 적절히 조절해 나가야 합니다.
13). 맨 마지막 washing할 때에 , 적정량을(1/2 or 1/5 of 총 부피)을 새로운 tube에 덜어줍니다. 나머지는 일단 glycerol을 섞어서 -20℃에 보관합니다.
※ -20℃에 보관할 때 절대로 bead가 얼어서는 안됩니다.
14). 새로운 tube에 있는 sample은 4X SDS-PAGE sample buffer을 넣어주어서 90~100℃에서 3~5분간 끓여줍니다. 이 단계에서 Bead와 붙은 결합이 끊어지게 됩니다. 그리고 SDS-PAGE를 다음과 같이 걸어줍니다.

※ 여기서 GST total은 Bead에 붙이기 전 lysis sample의 소량을 SDS-PAGE에 걸어준 것입니다. GST-fusion protein total도 마찬가지로 lysis sample의 소량을 걸어준 것입니다. 그리고 -alone은 bead에 binding후에 SDS-PAGE을 걸어 준 것입니다.
15). SDS-PAGE gel을 전기영동 한 후에, coomassive staining을 해주고, gel dry을 해줍니다. 그리고 나온 결과를 바탕으로 purification을 분석 발전된 전략을 세웁니다.
16). 그리고 다음 단계는 elution 단계 입니다. *이 단계는 모든 purificaiton조건을 만족스럽게 setting하고 나서 행하여지는 단계입니다. 이 단계 이후의 설명은 다시 washing 단계에서 시작하겠습니다.
17) Washing & elution
1. Washing에 사용할 lysis buffer를 준비하고 protease inhibitor를 섞어 놓습니다. Bead binding이 끝난 tube를 spin down 하여 bead를 down 시킵니다.

2. Pipette으로 상등액을 조심스럽게 덜어내어 버립니다. 이때 bead가 딸려 올 수도 있으므로 주의해야 합니다. Lysis buffer 1ml을 조심스럽게 pipette으로 넣은 후 살짝 resuspension 해주고 cold chamber에서 10분 동안 incubation 시킵니다.

3. 다시 원심을 돌려서 상등액을 제거하고 lysis buffer 1ml을 첨가하여 incubation 합니다.이 washing 과정을 4회 실시합니다.
4. Elution buffer를 준비하고 역시 protease inhibitor를 섞어 놓습니다. Washing이 끝난 bead를 spin down 후 상등액을 버리고 elution buffer 100㎕를 넣어 상온에서 10분 동안 incubation 시킵니다. Elution 후 spin down 해서 상등액을 새 tube로 옮깁니다. 충분히 elution이 될 때까지 반복적으로 실시합니다.

5. Elution을 통해 얻은 solution에는 원하는 단백질 외에 다른 물질들이 있습니다. 그 물질들을 없애고 원하는 단백질을 농축시키기 위해 dialysis와 ultrafiltration을 행해야 합니다.

3. 이제 elution 시킨 sample을 주입해야 합니다. Sample은 syringe를 이용하여 cassette의 모서리에 있는 구멍으로 주입을 합니다. 이때 바늘이 완전히 들어간 상태에서 주입을 해야 합니다. 또한 바늘에 의해 membrane이 상하지 않게 조심해야 합니다.

4. Sample 주입 후에 cassette 내에 있는 공기를 완전히 빼냅니다. cassette를 다시 bouy에 끼워서 buffer가 담긴 beaker에 띄워 dialysis를 행합니다. 1차 dialysis는 4℃에서 4~5시간 정도하면 되고 2차 dialysis는 4℃에서 over night 합니다. 이때 stirrer를 이용하여 beaker 안의 buffer을 살짝 교반 시키는 것도 좋습니다.

5. Dialysis 시킨 sample은 적정 농도로 농축을 시키기 위해 syringe를 이용하여 membrane으로부터 빼내야 합니다. 먼저 약간의 공기를 cassette에 syringe를 이용하여 밀어 넣고 아래쪽 모서리에서 sample을 빼냅니다. 빼낸 sample은 새 tube로 옮깁니다.

6. 이제 ultrafiltration을 시킵니다. 여기서는 millipore의 microcon을 사용할 것입니다. Sample reservoir와 filtrate vial을 준비 하고 filter가 vial에 들어가는 방향으로 결합합니다.

7. sample을 reservoir에 넣습니다. 이때 들어가는 양은 500㎕가 최대량 입니다. 12000rpm으로 25℃로 원심을 돌리는데 시간은 실험자가 원하는 농도로 되도록 조절을 해야 합니다. 보통 12분 정도는 돌려야 합니다.

8. 농축된 sample은 회수를 해야 합니다. Filter 부분에 남아있는 sample을 회수하기 위해 reservoir를 filter 부분이 바깥으로 향하도록 vial에 끼우고 살짝 원심을 돌립니다.

9. Vial에 모인 농축된 sample은 새 tube로 옮깁니다. 농도의 확인은 SDS-PAGE 를 통해 하게 되는데 이때는 확실한 농도를 아는 standard 단백질을 같이 걸어주어야 합니다. BCA 정량을 할 수도 있지만 다른 단백질의 함유여부를 확인 할 수 없기 때문에 적절하지 못한 방법이라